引言

除前述DNA基础上的分子检测外，还可通过RNA或蛋白的方式对相关分子进行检测。不同方法各有优缺点。此外，面对诸多方法，如何选择适合临床、适合自己单位实际情况的相关检测并让患者有最大获益，更是考验着病理医师的智慧。

【关键词】：分子诊断，预分析方法，二代测序（NGS），聚合酶链反应

【提要】
分析前注意事项，包括样本采集、储存和运输，以及样本评估，对于确保分子诊断测试的成功至关重要。
建议对小样本进行组织分类和最大化分子分析材料
分子方法，例如基于测序、基于杂交或聚合酶链
基于反应的具有不同的敏感性和特异性，适当的使用取决于应用
设计分子检测菜单需要考虑生物标志物、患病率、样本类型、和测试方法的局限性。

RNA基础上的检测方法

RNA的检测，首先是通过逆转录步骤将RNA转化为互补DNA（complementary DNA，cDNA）；然后通过前述检测DNA的方法进行分析。针对RNA的检测方法在检测融合及剪切变异时尤其有用。对于融合基因来说，RNA检测方法去除了内含子序列，因此检测更有效。此外，对RNA的检测可以直接确定最终转录是否在框内（in-frame）。对于剪切变异来说，DNA检测方法可以预测剪切事件；但检测RNA可明确到底是否发生了这样的剪切事件。RNA检测方法还可用于评估靶基因的相对表达水平，这一般是在微阵列或NGS检测平台中进行的。

蛋白基础上的检测方法

临床工作中，首选免疫组化检测蛋白，且可用于某些潜在分子生物学改变的标记。针对特异性突变蛋白的定性免疫组化可迅速检出潜在的DNA水平突变事件，如BRAF p.V600E、IDH1 p.R132H。免疫组化也可用于定量检测，高密度着色可用于基因融合的替代性标记（如肺癌中的ALK）、或基因扩增的替代性标记（如乳腺癌中的ERBB2）。根据具体临床情况，这类免疫组化指标可用于提示进一步行其他检查、或本身即可做出明确诊断。

分子检测方法涉及的分子包括DNA、RNA、蛋白，相关方法可检测序列改变、结构变化、拷贝数改变、核酸的共价修饰及蛋白的改变。具体可根据检测的分子类型、或被检测改变的类型进行分类，详见表1。

表1. 分子检测方法及相应特点概述

设计分子检测项目

分子诊断可为患者诊疗提供重要信息，比如协助诊断、改善对预后的预测能力、指导治疗方案，尤其对于精准用药特别关键。实际工作中，具体检测的指标需综合考虑临床应用、技术条件、性价比。具体来说，需征求相关专家（如病理医师、肿瘤医师、遗传学医师等）的意见并遵循专业学会的指南。有些标记物可能有多种检测方法，如IDH1突变的检测方法有免疫组化、RTPCR、ddPCR、Sanger测序、NGS。对于胶质瘤的诊断来说，可首选免疫组化；但对于确定急性髓系白血病是否适用IDH1抑制剂来说，可能最好选择PCR或测序的方法。

检测所需时间及性价比也要考虑到，因为这会影响到具体指标的选择、以及判断是否必须进行这一检测。比如肺癌，目前推荐多项标记物的检测，但根据具体方法，是单一指标进行检测、还是同时进行多项检测，要综合考虑所需时间及费用。有些实验室采取的是依次分别进行检测。相关指标如果不能全选，则更常见选择KRAS或EGFR突变，而不是ALK、RET、ROS1融合；如果分别各项检测，且临床情况允许，可考虑先进行KRAS或EGFR突变的DNA检测，然后在结果阴性的时候进行ALK、RET或ROS1的RNA检测。其他某些情况下，选择更为迅速的rtPC可能更为合适，比如转移性肺癌患者需迅速得到治疗时。

如果检测的是有多种检测方法、且不同肿瘤中阳性率不一的广谱肿瘤标记物，则检测方案的选择会很麻烦。具体如NTRK基因融合的检测：该基因融合具有相应靶向治疗方案，但不同肿瘤中的阳性率可低至5%、高达75%以上。从实用观点来说，很多实验室选择一个方案解决所有问题会很困难。这种情况下建议多种检测方案联合应用，如FISH检测NTRK融合几率高的肿瘤、免疫组化用于一般不会表达TRK且NTRK基因融合几率低的肿瘤，NGS方案用于免疫组化表达TRK、或其他检查为阴性情况下的检测。

确定了要检测的指标及具体检测方案后，实验室具体可采取FDA批准（approved）或FDA许可（cleared）的方法、或选择实验室所建立（laboratory-developed）的检测方法。FNA批准或许可的方法，是体外诊断（in-vitro diagnostics，IVD）试剂商生产且FDA批准或许可用于临床诊断的；实验室建立的方法可用检测套装、仅供研究的试剂、仅供特定分析的试剂、和/或通用试剂等进行检测。FDA批准或许可的方法在应用前必须进行验证，而实验室建立的方法也必须验证，以确定相关检测的性能特点。检测验证必须包括准确性、精确性、可检测范围、参考值、敏感性、特异性方面的评估。对于相关检测来说，关键是有恰当的校准、参考物、对照标本。

除了建立实验室内部的生物标记物检测外，还可考虑制定送至中心实验室的相关检测方案，如常见病的常见标记物在本实验室进行检测，而较罕见的标记物则送至中心实验室。这样可以让较小的实验室流程优化，取得较好的性价比。

总之，设计一个分子诊断清单可能是一项复杂的任务，但详尽规划、相互合作，可以制定出一个适合大部分情况、兼顾不同方案优缺点的分子诊断方案。

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参考文献

Ewalt MD, Hsiao SJ. Molecular Methods: Clinical Utilization and Designing a Test Menu. Surg Pathol Clin. 2021;14(3):359-368.

doi:10.1016/j.path.2021.05.001