作为病理医师，了解并掌握分子病理相关要求已迫在眉睫

不管我们是否情愿，分子病理在诊断领域的攻城略地已是不争的事实。一方面，其应用范围已扩展至诸多不同的瘤种；另一方面其应用遍及疾病诊断、预后判断、治疗方案的制定。因此，作为病理医师，了解并掌握分子病理相关要求已迫在眉睫。2021年，《Surg Pathol Clin》杂志曾组织刊发了一系列分子病理的文章。为帮助大家系统的了解相关问题，我们公众号将逐步编译介绍这些内容。

分子诊断主要着眼于通过多种方法来评估诸多分子，进而分析送检标本中的遗传学改变

本次编译文章将详述具体实践中的相关注意事项。

检测前注意事项

标本收集、转移及储存都是确保标本可以进行分子检测、不会出现假阴性的重要因素。分子诊断常用标本有福尔马林固定石蜡包埋的组织、细胞块、涂片、血液、骨髓抽吸标本、新鲜或冰冻组织。血液及骨髓标本一般收集在EDTA管或柠檬酸盐管中。这类供分子检测的标本一般不建议用其他收集管，如含肝素的试管，因为肝素可以影响核酸抽提、和/或抑制PCR扩增。其他检测可能需要特殊的试管，如RNA相关检测需要用加入RNA稳定剂的采血管，循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）常用加入了有核细胞稳定剂的采血管。福尔马林固定石蜡包埋标本中，则在标本收集、固定、储存等方面有诸多因素可影响由此抽提的DNA或RNA的质和量。分子检测标本中关键的检测前因素，可参见表1。

表1. 分子检测的检测前注意事项

1. 标本收集

标本收集至标本固定的时间，称为缺血时间。研究发现，缺血时间对DNA的数量及质量无显著影响。不过对于RNA相关检测来说，由于RNA稳定性方面的问题，缺血时间会显著影响检测。尤其基因表达的相关检测对这一因素的影响非常敏感，因此应尽可能的缩短缺血时间。

2. 组织固定

病理日常工作中，标准的固定液是10%中性缓冲福尔马林，通过交联DNA及蛋白而保存组织。其他固定液如B5、Bouin、Zenker等，可诱导金属-蛋白复合物形成或脱嘌呤，因此如果后续要做分子检测，则不推荐应用。

固定的时间也会影响核酸的质量。用10%的中性缓冲福尔马林时，已有报道称过度固定（时长超过72小时）可影响DNA的数量及质量。包括酒精固定的细胞涂片及细胞块等细胞学标本也可得到高质量的核酸并可用于分子检测。

3. 脱钙

目前有多种脱钙剂，但很多都含有酸，可破坏DNA并导致脱嘌呤。因此脱钙的过程可能会导致标本不适于分子检测，因此应尽可能避免。也有些脱钙剂不会破坏DNA，如EDTA，因此可用于分子检测。由于难以预料后续是否需进行分子检测，因此不建议用含酸的脱钙液对全部标本进行处理；相反，应有一个组织块用EDTA脱钙、并在报告中记录，以备后续的分子检测所需。

EDTA脱钙所用浓度是10%至20%，一般为14%，且与pH有关。活检标本的大小会影响脱钙效率，小标本需16-24小时，较大标本可能需数天。其他影响脱钙速度的因素还有温度、搅动的情况、容器的大小等，EDTA溶液与标本的体积比一般为20:1，且应定期更换。

4. 标本储存及转移

新鲜组织或体液，应立即送至实验室并尽可能快的做出处理，尤其需要RNA类检测时。加入稳定剂后，溶解细胞并稳定核酸酶，可以保存标本一定时间后进行核酸抽提。

另一个问题是标本检测循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）：如果ctDNA检测的标本收集在未加有核细胞稳定剂的试管中，则应在收集后6小时内处理。标本应在质控状态下保存，以将降解控制在最低水平。在保护剂中长期储存会导致核酸的降解。与此类似，长期保存的福尔马林固定石蜡包埋组织也会有DNA的碎片化、胞嘧啶的脱氨基，且可导致DNA质量欠佳从而扩增失败和/或序列假象（sequence artifacts）.

5. 标本评估

对于体细胞检测来说，必须评估送检标本中的肿瘤细胞含量。足够比例的肿瘤细胞，是确保肿瘤内相关变化在标本分子检测范围之内所必需。肿瘤细胞比例不足，可导致假阴性结果。

肿瘤比例的评估一般是在HE切片中人工审核，但部分实验室也通过数字图像分析来降低评估中的主观性。Sanger测序需要肿瘤细胞比例20%-40%，其他高敏检测所需肿瘤细胞比例可低至百分之几。不过由于肿瘤比例估计的不精准，因此常需进行肿瘤富集、使其超出检测所需最低比例；同时确保可以检出亚克隆突变或肿瘤异质性。具体常采用的方式有用手术刀等刮下肿瘤区域，或在显微镜下对切片中的小灶区域进行显微切割。激光显微切割是另一种肿瘤富集方法，但其价格高、时间长，限制了其广泛应用。

6. 分子检测的组织分配

对于微创所得小标本来说，确保保留足量组织用于诊断和后续分子检测可能具有挑战性。比如对于肺癌来说，建议进行检测的指标有PD-L1、EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS、ERBB2、MET、RET、NTRK。这些指标的检测可通过多种方法的组合完成，具体如免疫组化、FISH、靶向PCR、DNA测序、和/或RNA测序，但每一种方法对组织都有最低量的要求。如果依次进行检测，则组织块需要多次重修，标本会迅速耗竭。尽可能保留标本供检测的方法有：每个穿刺芯单独包埋，对组织块进行浅修，包括细胞学标本在内的所有可用标本（如涂片、细针抽吸标本、细胞块）都可进行检测，用ctDNA进行检测。病理医师应与肿瘤医师、外科医师、介入医师密切沟通，并结合组织学、免疫组化、细胞遗传学、分子检测相关结果来恰当分配标本。

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参考文献

Ewalt MD, Hsiao SJ. Molecular Methods: Clinical Utilization and Designing a Test Menu. Surg Pathol Clin. 2021;14(3):359-368.

doi:10.1016/j.path.2021.05.001